T4 DNA ligaas (5 U/μL)

 

Toote nimi	Kass. Ei.	Spets.
T4 DNA ligaas (5 U/μL)	G3340-50	250 U
	G3340-100	500 U

 

 

T4 DNA ligaas katalüüsib fosfodiestersideme moodustumist kõrvuti asetsevate 5' fosfaadi ja 3' hüdroksüülotsade vahel dupleks-DNA või RNA vahel. See ensüüm ühendab nüri otsad ja sidusad otsad, samuti parandab üheahelalisi täkkeid dupleks-DNA-s ja mõnedes DNA/RNA hübriidides.

Aktiivsuse ühiku määratlus: Üks ensüümi Weissi ühik katalüüsib 1 nmol [32PPi] muundamist ATP-ks 20 minuti jooksul 37 kraadi juures. Üks Weissi ühik võrdub ligikaudu 200 kohesiivse otsa ligeerimisühikuga (CEU).

T4 DNA ligaasi säilituspuhver: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM KCl, 1 mM DTT, 50% (maht/maht) glütserool.

5 × T4 DNA ligaasi puhver: 250 mM Tris-HCl (pH 7,6), 50 mM MgCl2, 5 mM ATP, 5 mM DTT, võimendaja.

 

 

Laev märja jääga; poodi -20 kraadi juures, kehtib 12 kuud.

 

 

Komponendi number	Komponent	G3340-50	G3340-100
G3340-1	T4 DNA ligaas	250 U (50 μL)	500 U (2×50 μL )
G3340-2	5 × T4 DNA ligaasi puhver	1 ml	2 × 1 ml
Käsiraamat		Üks eksemplar

 

 

1. Lisage järgmine (soovitatav 10-uL reaktsioonisüsteem) autoklaavitud 15-mL mikrotsentrifuugi tuubi:

Komponent	Helitugevus
5 × T4 DNA ligaasi puhver	2 μL
T4 DNA ligaas	0.5-1 μL
Lineaarne vektor DNA	X μL
Sisestage DNA	Y μL
Nukleaasivaba vesi	10 μL-ni
Kokku	10 μL

2. Segage õrnalt ja tsentrifuugige lühidalt, et viia sisu katseklaasi põhja.

3. Sidusate otste saamiseks inkubeerige 25 kraadi juures 5-30 minutit; Nüri otsa jaoks inkubeerige 25 kraadi juures vähem kui 2 tundi või üle öö 4 kraadi juures.

4. Asetage katseklaas jääle ja jätkake viivitamatult transformatsioonireaktsiooni läbiviimisega. Või võite ligeerimissegu hoida –20 kraadi juures, kuni olete valmis.

Tehke transformatsioonireaktsioon

5. Lisage sobiv ligeerimissegu keemiliselt pädevatesse rakkudesse (nagu E.coli DH5, E.coli Top10 jne) ja segage õrnalt koputades. Ärge segage pipetiga üles ja alla. Ülejäänud ligeerimissegu(sid) saab säilitada temperatuuril –20 kraadi.

6. Inkubeerige 30 minutit jääl.

7. Inkubeerige täpselt 90 sekundit 42 kraadises veevannis. Ärge segage ega loksutage.

8. Eemaldage tsentrifuugitorud 42-kraadisest vannist ja asetage need 2-5 minutiks jääle.

9. Lisage 900 µL SOC või LB söödet. Saastumise vältimiseks tuleb kasutada steriilset tehnikat. Loksutage tsentrifuugitoru(sid) 37 kraadi juures 1 tund kiirusel 225 p/min loksutamisinkubaatoris.

10. Kandke igast transformatsioonitsentrifuugi katseklaasist sobiv kogus eraldi märgistatud LB agarplaatidele. Ülejäänud transformatsioonisegu võib säilitada 4 kraadi juures ja soovi korral järgmisel päeval välja panna.

11. Pöörake plaat(id) ümber ja inkubeerige 37 kraadi juures üleöö.

Analüüsige transformante

12. Valige kolooniad ja analüüsige plasmiidi eraldamise, PCR või sekveneerimisega.

 

 

1. Soovitatav on reaktsioonisüsteem valmistada jääl.

2. DNA insertide kiireks ligeerimiseks vektoritega, et toota ringikujulisi rekombinantseid molekule, soovitatakse kasutada molaarsuhet 3:1–10:1 insert:vektor.

3. Enne kasutamist sulatage 5X DNA ligaasi reaktsioonipuhver toatemperatuuril ja segage sadestunud materjali lahustamiseks intensiivselt keerisega.

4. T4 DNA ligaasi tuleb hoida -20 kraadi juures kuni 5-10 minuti jooksul pärast kasutamist ja pärast kasutamist viivitamatult taastada -20 kraadi.

5. Kui insert-DNA on tömbi otsaga, tuleks restriktsiooniendonukleaasiga lõhustamise järgselt vektorit defosforüülida (soovitatav G3400), et vältida selle iseringlust.

6. Oma ohutuse ja tervise huvides kandke kaitseprille, kindaid või kaitseriietust.

 

 

Kuum tags: t4 dna ligaasi (5 u/ul), Hiina t4 dna ligaasi (5 u/ul) tootjad, tarnijad, tehas